當(dāng)實驗室更換內(nèi)毒素檢測方法或更換試劑供應(yīng)商時，需進(jìn)行方法比對與橋接驗證。比對實驗需選取至少 3批代表性樣品，分別用新舊方法檢測，計算結(jié)果相關(guān)性（如相關(guān)系數(shù) R?≥0.95）和偏差（≤20%）。橋接驗證還需評估新方法的特異性、靈敏度是否與舊方法一致，如確認(rèn)對高風(fēng)險樣品（如含 β- 葡聚糖的樣品）的抗干擾能力相當(dāng)。若方法變更涉及法規(guī)申報產(chǎn)品，需將驗證數(shù)據(jù)納入申報資料，證明變更后方法仍能有效控制內(nèi)毒素風(fēng)險，符合 FDA、NMPA 等監(jiān)管機構(gòu)對方法變更的合規(guī)性要求。 內(nèi)毒素檢測的方法多樣性、多影響因素及實驗干擾，會導(dǎo)致自檢數(shù)據(jù)與廠家數(shù)據(jù)存在差異。北京細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證

內(nèi)毒素檢測重組級聯(lián)試劑（rCR）與天然鱟試劑在原料、性能和可持續(xù)性上存在本質(zhì)區(qū)別。原料方面，天然鱟試劑依賴鱟血采集，受動物資源限制，而 rCR 通過基因工程表達(dá) C、B 因子及凝固酶原，無動物源性，供應(yīng)穩(wěn)定。特異性上，天然鱟試劑因含 G 因子，易與 β-D 葡聚糖反應(yīng)產(chǎn)生假陽性，而 rCR 剔除 G 因子，只對內(nèi)毒素特異性響應(yīng)，從機制上消除干擾。批間一致性方面，天然鱟試劑受鱟個體差異影響，批間 CV 值較高；rCR 成分明確且生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化，批間差異明顯降低，CV 值≤15%。兩者靈敏度相當(dāng)（0.005EU/mL），但 rCR 無需面臨鱟資源政策限制，更符合動物福利趨勢和長期質(zhì)控需求，是天然鱟試劑的理想替代。 上海非動物源內(nèi)毒素檢測LER現(xiàn)象細(xì)菌內(nèi)毒素檢測中，rCR 加標(biāo)回收率穩(wěn)定在 50%-200% 藥典范圍，可準(zhǔn)確完成檢測。

鱟試驗法（LAL 法）是細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的經(jīng)典方法，依據(jù)反應(yīng)監(jiān)測方式可分為三類：凝膠法、濁度法和顯色法。凝膠法通過觀察是否形成凝膠判斷內(nèi)毒素是否超標(biāo)，其優(yōu)勢是操作簡便、成本較低，適用于定性或半定量檢測，如**器械初篩；濁度法通過監(jiān)測反應(yīng)體系濁度變化速率定量內(nèi)毒素，靈敏度高（可達(dá) 0.005 EU/mL），適用于生物制品原液等高精度需求場景；顯色法基于顯色底物的吸光度變化定量，抗干擾能力較強，適配復(fù)雜基質(zhì)樣品（如含蛋白質(zhì)的注射液）。三種方法均需嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度（37℃±1℃）和時間，確保結(jié)果可靠性。

隨著動物保護(hù)理念和法規(guī)要求升級，重組因子C法（rFC法）作為 LAL 法的替代技術(shù)逐漸普及。重組 C 因子是以基因重組的方式表達(dá)的 LAL 試劑中的 C 因子，C 因子被內(nèi)毒素活化后切割熒光底物產(chǎn)生游離熒光基團(tuán)，通過檢測熒光信號可以反應(yīng)活化后的蛋白酶活性，并由此可以推算出內(nèi)毒素的含量。與傳統(tǒng) LAL 法相比，rFC 法無需依賴鱟血資源，避免了天然 LAL 試劑批間差異大、易受 β- 葡聚糖干擾等問題，且反應(yīng)特異性更強。目前，《美國藥典》、《歐洲藥典》等法規(guī)已收錄 rFC 法，歐盟更推薦其用于疫苗等高風(fēng)險產(chǎn)品檢測，在保證檢測準(zhǔn)確性的同時，符合動物福利和可持續(xù)發(fā)展要求。 “低內(nèi)毒素回收（LER）”可能導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測假陰性，對患者用藥**構(gòu)成潛在隱患。

內(nèi)毒素檢測鱟試劑的反應(yīng)受pH的干擾。在進(jìn)行檢測時，要調(diào)節(jié)被測溶液的pH值，使鱟試劑與供試品溶液的混合溶液pH值落在鱟試劑指定的使用pH范圍內(nèi)（一般鱟試劑作用pH值在6.0~8.0范圍內(nèi))。用于調(diào)節(jié)pH值的試液或溶液（酸或堿)，可采用BET用水配制，并將溶液在無熱原容器中儲存；必須對試液或溶液進(jìn)行驗證，以證明不含可檢出的內(nèi)毒素并且無干擾因素。調(diào)節(jié)pH試劑（酸或堿）的添加量，不應(yīng)該超過供試品的1092。如果超過10%，則在進(jìn)行計算時，將DH試劑的添加量的系數(shù)計算進(jìn)去。 湖州申科生物提供重組級聯(lián)方法的技術(shù)轉(zhuǎn)移服務(wù)，含方法驗證報告，助力內(nèi)毒素檢測方法平穩(wěn)切換。江蘇非動物源內(nèi)毒素檢測凝膠法鱟試劑

內(nèi)毒素檢測假陰性多因樣品抑制，梯度稀釋結(jié)合加標(biāo)試驗可定位偏差原因。北京細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證

重組試劑（rCR、rFC）是解決 LER 的重要工具，優(yōu)化內(nèi)毒素檢測性能。重組鱟試劑（rCR）通過基因工程表達(dá) C、B 因子及凝固酶原，剔除 G 因子，完全模擬天然鱟級聯(lián)反應(yīng)，靈敏度達(dá) 0.005EU/mL，與天然方法橋接容易，能避免 LPS 結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的假陰性；重組 C 因子（rFC）靈敏度 0.005-5EU/mL，性狀穩(wěn)定、均一性好，雖需熒光酶標(biāo)儀，但對部分 LER 場景（如無蛋白質(zhì)干擾）適配性強。二者擺脫了天然鱟試劑的局限，為內(nèi)毒素檢測提供更抗 LER 的選擇，契合行業(yè)技術(shù)趨勢。 北京細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證